Tooted

Uus kõrgjõudlusega vedelikkromatograafia test glükosüültransferaaside jaoks, mis põhineb antraniilhappega derivatiseerimisel ja fluorestsentsi tuvastamisel.

Analüüsid töötati välja 2-aminobensoehappe (2AA; antraniilhape, AA) ainulaadse märgistamiskeemia abil, et mõõta nii β1-4 galaktosüültransferaasi (GalT-1) kui ka α2-6 sialüültransferaasi (ST-6) aktiivsust suure jõudlusega vedelikuga kromatograafia (HPLC) fluorestsentstuvastusega (Anumula KR. 2006. Edusammud fluorestsentsderivatiseerimismeetodites glükoproteiini süsivesikute kõrgsurvevedelikkromatograafiliseks analüüsiks. Anal Biochem. 350:1-23).Aktseptoritena kasutati N-atsetüülglükoosamiini (GlcNAc) ja N-atsetüüllaktosamiini ning GalT-1 ja ST-6 doonoriteks vastavalt uridiindifosfaat (UDP)-galaktoosi ja tsütidiinmonofosfaat (CMP)-N-atsetüülneuramiinhape (NANA).Ensümaatilised tooted märgistati in situ AA-ga ja eraldati substraatidest TSKgel Amide 80 kolonnis, kasutades normaalfaasi tingimusi.Ensüümiühikud määrati piikide pindaladest, võrreldes samaaegselt derivatiseeritud standarditega Gal-β1-4GlcNAc ja NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Määrati analüüside lineaarsus (aeg ja ensüümi kontsentratsioon), täpsus (sisene ja interanalüüs) ja reprodutseeritavus.Leiti, et analüüsid olid kasulikud ensüümi aktiivsuse jälgimisel eraldamise ja puhastamise ajal.Analüüsid olid väga tundlikud ja toimisid samaväärselt või paremini kui traditsioonilised radioaktiivsel suhkrul põhinevad mõõtmised.Testivormingut saab kasutada ka teiste transferaaside aktiivsuse mõõtmiseks, eeldusel, et süsivesikute aktseptoritel on märgistamiseks redutseeriv ots.IgG abil töötati välja glükoproteiini aktseptorite analüüs.IgG glükaanide (biantennaarsed G0, G1, G2, mono- ja disialüülitud) eraldamiseks töötati välja lühike HPLC profileerimismeetod, mis hõlbustas GalT-1 ja ST-6 aktiivsuste kiiret määramist.Lisaks peaks see profiilide koostamise meetod osutuma kasulikuks IgG glükaanide muutuste jälgimiseks kliinilistes tingimustes.