Tooted

5-fluorouratsiili (5-FU) ja kahe endogeense monofosfaatnukleotiidi mitme metaboliidi spetsiifiliseks kvantifitseerimiseks töötasime välja originaalse meetodi, mis põhineb vedelikkromatograafia-tandem-massispektromeetrial (LC-MS/MS).See test võimaldas määrata: (i) 5-fluoro-2'-desoksüuridiin-5'-monofosfaadi (5-FdUMP) rakusisest tootmist 5-FU või 5-fluoro-2'-deoksüuridiinist (5-FdUrd) (ii) 5-FdUMP kontsentratsiooni mõju rakusisese 2'-desoksüuridiin-5'-monofosfaadi (dUMP)/tümidiin-5'-monofosfaadi (TMP) suhtele ning (iii) 5-FdUMP sekretsiooni ulatusele ja 5-FU inimese kultiveeritud rakkudest ABC transporterite abil.Meie katsetingimustes inkubeeriti rakke 5-FU või 5-FUrd-ga.Seejärel sadestati raku valgud metanooliga.See protseduur tagas suure ekstraheerimise taastumise.Lisaks määrasime rakkudest 5-FU ja 5-FdUMP sekretsiooni mõõtmiseks nende molekulide kvantifitseerimise söötmes.Sööde süstiti kas otse (5-FU) või ekstraheeriti tahke faasiga, kasutades Oasis Wax ekstraheerimiskassetti (5-FdUMP).Analüütide eraldamine viidi läbi dC18 Atlantis 3, 5 μm (100 mm × 2, 1 mm id) kolonnis isokraatliku režiimiga, kasutades liikuva faasina ammooniumformiaadi puhvrit/metanooli/vett (5/5/90, maht/maht).Jooksu aeg ei ületanud 6,2 min.Analüüdid ioniseeriti elektropihustusliideses negatiivse iooni režiimis.Me valideerisime meetodi vastavalt ühenditele vahemikus 2,5–150 ng ml-1.Testisisene ja -vaheline varieeruvus oli seitsme päeva jooksul alla 10%.Kõik ühendid olid rakkudes või söötmes stabiilsed, kui proove hoiti temperatuuril –20 °C vähemalt kaks nädalat ja pärast kolme külmutamis-sulatustsüklit.Maatriksiefekti mõlemas söötmes ei täheldatud.